玛咖(MACA)无菌培养物的建立

外植体的选择：选择适当的玛咖外植体对于快速繁殖能否成功是极为重要的。选择外植体时一般应注意以下几个问题:第一，外植体的大小。这要由培养的目的来决定，如为了得到无病毒植株需使用分生组织(生长锥带1一2个叶原基)，如为一般繁殖或原材料经鉴定是不带病毒的可使用茎尖(除分生组织外还带有少量幼叶)、芽或带芽的切段作为外植体。外植体越小，带病毒和其他的病源体就越少，但是越难培养；反之，则带病毒越多，但容易培养。第二，取材植株的生理状态对培养的成败也很重要。一般在春天芽生长旺盛，并有芽鳞片的保护，不易污染。为了避免季节的影响，在有条件时可以将植物放在光、温度条件稳定的人工气候箱或温室进行。第三，取材的部位也需要注意。在外植体诱导形成愈伤组织时，可以采取植株的不同部位，如根、茎、叶，不同部位的诱导能力是不同的。我们取玛咖植株的根、茎、叶接种到相同的培养基中，诱导愈伤组织。15天后，小块叶片明显增厚，体积膨大，周围先形成愈伤组织。而接种的玛咖根、茎只有少量材料形成愈伤组织;30天的统计数字表明，以玛咖植株不同部位的材料做外植体，其愈伤组织诱导率差异明显，叶的诱导率高达52%根、茎的诱导率较低，说明玛咖组织培养中外植体部位对愈伤组织的诱导有一定影响。

　　植物材料的消毒:由于大多数植物的内部是无菌的，所以只要进行彻底的表面消毒就可以得到无菌的材料。一般先用水将玛咖种子表面的尘土洗去，然后用表面消毒剂消毒灭菌。最常用的表面消毒剂是5%一10%次氯酸钠溶液、10%左右的次氯酸钙或0.1%～1.0%的升汞，消毒时间在几分钟到十分钟左右。为了使消毒剂能更好地浸润表面，常在消毒剂溶液中加入0.01%～0.1%的表面活性剂，如吐温20或80等，或者在种子浸入消毒剂之前先用70%～75%的酒精浸几秒到几十秒钟。消毒后要用无菌水将材料冲洗干净，特别是用升汞消毒后更要多洗几次，至少5次以上。

　　消毒后的种子接入MS固体培养基中，2周后长至2～3cm高，即得到所需的无菌苗，可剪取其叶、茎、根作为外植体材料。

　　能否得到无菌玛咖的培养物不但决定于所使用的表面消毒剂的种类和时间，也和正确的操作方法有关，在接种过程中应该经常消毒工具，使用正确的操作方法，避免各个外植体和组织块之间的交叉感染。

　　褐变及其防止： 很多植物含有丰富的多酚化合物，接种时由于切割和剥离使组织受到伤害，这些化合物在多酚氧化酶的作用下氧化发生褐变，此现象在很多木本植物的中尤其严重。这些氧化产物能使外植体和培养基变黑并严重抑制外植体生长和分化的能力，褐变常使最初培养物的建立受到阻碍。现在采用各种方法试图防止褐变的发生并在某些植物上得到一定的效果，但还没有普遍适用的有效方法。我们在玛咖细胞培养中常用的方法是加入抗氧化剂，如抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等;或是将外植体不断地转移到新鲜的培养基上;也可在培养基中加人1%左右活性炭，但由于活性炭同时也吸附培养基中的激素等物质，故常会影响外植体的生长和分化；此外，还可采取开始阶段在黑暗中或弱光下进行培养，因为光照能促进多酚化合物的氧化。当然，通常是将以上几种方法结合起来使用，效果会更好，能有效防止外植体的褐化问题。

　　基本培养基和培养条件:现在用于快速续殖的基本培养基有很多种，常用的有MS、B5等。通常在整个培养过程的各个阶段使用同一种基本培养基，但有时在第三阶段诱导根的形成时使用盐浓度较低的基本培养基会得到更好的效果。在MS、B、L、White等基本培养基中经过实验比较，发现MS基本培养基较好，有利于玛咖的快速繁殖。

　　对激素的要求，经常是很不相同的，而且激素在玛咖快速繁殖中起着非常重要的作用。关于这方面的情况将在以后进行论述。

　　由于培养物在培养基中不进行光合作用，因而需要培养基提供碳源。用得最多的碳水化合物是蔗糖，有时也使用葡萄糖和果糖及其他糖类化合物，浓度一般在2%～3%左右。在玛咖快速繁殖中使用得最多的是固体培养基，以琼脂作为固化剂。

　　其他培养条件包括光照、温度和湿度等，除特殊要求外，一般在整个过程中都采用日光灯作光源，光强度在1000～3000勒克司。光周期使用16小时光照，8小时黑暗。在快速繁殖中光照的作用不是满足培养物光合作用的需要，而是用于植物的光形态建成。常用的培养温度在25℃左右。恒定的温度对玛咖生长有利，较少采用日夜变温的培养方法。由于在培养容器内的相对湿度较大，对于培养室湿度的控制要求不十分严格。